BEZ235和TSA协同抑制肺癌机制及Ezrin蛋白的标志物作用研究

【摘要】研究背景：肺癌是发病率及死亡率均占第一位的恶性肿瘤,全球以及我国的肺癌发病率正呈逐年递增的趋势。现已公认,转移及耐药是导致肺癌患者死亡的主要原因,因此,明确肺癌的转移机制、发现有效的治疗靶点是克服肺癌的关键。P13K抑制剂BEZ235和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)是有效的小分子靶向肿瘤治疗药物,但高剂量用药后的副作用及耐药性限制了其疗效。最近研究表明,不同的分子靶向治疗药物联合用药可以明显降低用药剂量,且显示出较好的克服耐药及协同抑制肿瘤的作用,有关BEZ235与TSA联合应用在胰腺癌和前列腺癌中的研究已有明确报道,但在肺癌中的作用及机制尚不清楚。我们的前期研究发现,Ezrin基因及其蛋白在乳腺癌和宫颈癌等上皮间质转化过程中起重要作用,是一种重要的癌蛋白。因此,深入研究Ezrin在BEZ235与TSA联合应用抑制肺癌中的作用有重要的理论指导意义。研究目的：本研究通过体内外分子生物学实验研究BEZ235和TSA联合用药对A549肺癌细胞生物学行为的影响,分析其协同抑制肿瘤的作用及机制,并初步探讨Ezrin信号通路在BEZ235和TSA联合抑制肺癌中作用及其预后判定指标作用,为肺癌临床治疗提供新的用药选择及分子标志物。材料和方法：1)体外实验：MTT及平板克隆形成实验检测BEZ235及TSA联合用药对肺癌细胞系A549的增殖抑制作用；流式细胞术Annexin-V/PI双染法及Hoechst3334荧光染色法检测药物处理后的A549细胞凋亡率的变化；Westernblot方法检测BEZ235及TSA处理后PI3K/Akt、HDAC及Ezrin信号通路的相关蛋白改变及对EMT标志物的影响。进一步以siRNA方法沉默Ezrin的表达后检测诱导EMT的能力,明确Ezrin与EMT的相关性。通过划痕实验验证两药协同抑制A549细胞迁移的能力；2)体内实验部分：建立A549细胞系裸鼠移植瘤模型,随机分成单独给药、联合给药及对照组。连续给药4周后检测两药合用对A549移植瘤的协同抑制能力,并将瘤组织制成病理切片后,免疫组化分析Ki67、Ezrin及p-Ezrin蛋白的表达情况；RT-PCR方法对比分析21例新鲜肺癌、15例癌旁及8例正常肺组织的Ezrin,p-Ezrin的mRNA表达情况；免疫组化方法检测150例NSCLC、癌旁组织及正常组织的Ezrin,p-Ezrin的蛋白表达情况,并分析其异常表达与临床病理学特征之间的相关性,生存期分析验证Ezrin及p-Ezrin对患者预后评估的价值。结果：1)MTT及平板克隆实验结果显示BEZ235与TSA协同抑制A549细胞的增殖及克隆形成能力;流式细胞术及Hoechst染色结果表明联合用药增强A549细胞的凋亡诱导能力；Westernblot结果显示BEZ235及TSA下调PI3K/Akt及HDAC相关信号通路蛋白；划痕实验结果显示,联合用药抑制A549的损伤愈合能力；2)BEZ235及TSA协同抑制A549细胞的裸鼠移植瘤成瘤能力,且联合用药组肿瘤组织坏死增多,Ki67、Ezrin及p-Ezrin表达均下调；3)BEZ235及TSA联合用药诱导A549细胞EMT形成,如E-cad表达增高,snail表达下调：siRNA方法沉默A549细胞Ezrin基因后,Westernblot检测显示A549细胞间质细胞表型得到增强；4)RT-PCR方法检测显示肺癌组织Ezrin的mRNA水平明显高于癌旁正常组织；免疫组化结果表明,Ezrin、EzrinThr-567及EzrinTyr-353的阳性率(62.7%、63.3%、71.3%)明显高于癌旁组织(31.3%、14.0%、11.3%)及正常肺组织(35.7%、14.3%、7.1%),差异具有显著性(p<0.01),并与患者的临床分级,病理分化,有无淋巴结转移密切相关；生存期分析结果表明EzrinThr-567的异常表达与NSCLC的生存期密切相关(p<0.05),而在早期NSCLC中Ezrin与EzrinThr-567均与生存期密切相关(p<0.05)。结论：1)BEZ235与TSA联合应用可以在体内外协同抑制A549肺癌细胞；2)BEZ235与TSA通过EMT抑制肺癌A549细胞的迁移；3)Ezrin信号通路关键分子在肺癌细胞EMT过程中起重要作用；4)Ezrin及其磷酸化蛋白可以作为NSCLC不良预后的分子标志物。
【作者】金铁峰；
【导师】林贞花；
【作者基本信息】延边大学，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】非小细胞肺癌；埃兹蛋白；BEZ235；曲古抑菌素A；上皮间质转化；

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